康普森小课堂 | 聊一聊酵母双杂交技术

来源: 发表日期:2018-09-25 浏览量:29

蛋白质是基因表达的产物,其存在方式直接与生物功能相关,所以研究蛋白质之间的相互作用是非常必要的。蛋白质相互作用的研究方法包括酵母双杂交技术、pull down实验、免疫共沉淀、荧光共振转移技术等等。酵母双杂交技术简便、灵敏、高效,在蛋白互作的研究中得到了广泛的应用。

今天跟随小编一起来了解一下酵母双杂交技术吧。

蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础,研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验,它是由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应,这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的。BD可识别DNA上的特异序列, 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游, AD可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。二者对于基因的转录活化都是必须的。


转录因子活化示意图(以GAL4蛋白为例)


在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时,DNA结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合,转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中,通过基因工程的方法在GAL4启动子上游激活序列(UASs)和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2、HIS3、MEL1(或LacZ),因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。


酵母双杂交系统的原理图

酵母双杂交系统特点与优势

1. 融合体蛋白之间的互作在真核酵母细胞内进行,蛋白质保持天然的折叠状态,更接近于体内的真实水平。

2. 双杂交系统的敏感度非常高,蛋白互作易被检测到。

3. 在筛选文库时,双杂交系统能够得到编码互作蛋白的基因序列,省略了其它体外检测蛋白互作方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。


酵母双杂交技术的应用


正如基因组研究计划曾给科研工作者以巨大希望一样,利用酵母双杂交技术去探索纷繁复杂的蛋白质之间的联系,为我们获得越来越多的未知生物学信息提供了可能性。



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